成果名称: 动物用抗菌肽菌株构建、高效表达研究及产业化
登记日期: 2021-09-08
完成单位: 广东海纳川生物科技股份有限公司
完成人员: 周玉岩,逯佩凤,黄自然,张珂卿,吴先纯,李长洪,张宇喆
研究起止日期: 2012-03-01至2014-03-31
主要应用行业: 农、林、牧、渔业
高新技术领域: 生物医药与医疗器械
评价单位: 广东省科学技术厅
评价日期: 2015-04-10
成果简介: 1、课题来源与背景:课题来源于广东省科技计划项目,专项资金80万,自有资金1047.76万。由于抗生素的广泛使用导致出现了越来越多的超级细菌,严重威胁人类和禽畜的健康。随着农业部发布“禁抗令”,寻找新型的抗菌物质成为畜牧业关注的热点。抗菌肽因具有高效杀菌活性和独特的作用机制,被认为是可安全使用的新型抗菌物质之一。抗菌肽菌丝霉素(Plectasin)是从腐生子囊菌 (Pseudoplectania nigrella) 分离得到的首例真菌防御素,对革兰氏阳性细菌具有广谱抗菌活性,其功能活性、作用机理、结构改造及药代动力学分析等方面已有广泛的研究,为菌丝霉素的应用奠定了坚实的理论基础。 2、技术指标: (1)构建的抗菌肽工程菌能高效、稳定的表达抗菌肽,表达量达 30000U/ml;
(2)提高热稳定性,100℃灭活 30 分钟,抗菌肽杀菌效价保持 90%以上,热稳定性好,可高温灭火,防止菌体及质粒扩散;
(3)经原材料及配方工艺、菌种筛选,工艺技术优化,发酵液中生物活性抗菌肽蛋白表达量达 5mg/ml;
(4)抗菌肽制剂工艺的设计与优化,产品质量稳定,常温储存一年,生物活性保持不变。经济指标∶本项目实施达产后实现年产 200 吨抗菌肽制剂产品(富力泰∶ 2000U/g),实现年销售额 3200 万,利税 960 万。随着生产规模的扩大和生产技术的不断完善,后期投入销售市场开拓的费用降低,单位总成本还可有一定的下降空间。 3、技术的创造性与先进性: (1)抗菌肽重组工程菌的构建 本项目抗菌肽基因根据天然抗菌肽的氨基酸序列,以柞蚕抗菌肽A 的 1-11 位氨基酸及抗菌肽 D 的 12-37 位氨基酸合并为杂合肽 AD, 同时采用点突变的方法使第 37 位的赖氨酸改变成天门冬酰胺,保持天然的 C-端酰胺基结构,提高了杀菌效价及稳定性,而其基因启动子a-factor 及其前导序列将菌体合成的抗菌肽分泌到细胞外,有利于抗菌肽的分离及有效作用的发挥。 (2)抗菌肽重组工程菌的高效表达 以工程菌工业化发酵生产抗菌肽,发酵周期短,发酵过程稳定可控,发酵液生物活性高,可规模化生产,生产成本低,产品质量稳定, 且不受季节和气候变化等外在环境的影响。本研究通过对重组工程菌培养基配方及发酵条件的优化,提高抗菌肽表达水平,降低发酵成本。 (3)抗菌肽稳定化制剂工艺的研究 基于抗菌肽分子量小、多为带正电荷多肽,半衰期短的特点,开展抗菌肽微囊化研究,相对延长抗菌肽体内半衰期,实现抗菌肽体内缓控释,为抗菌肽奠定良好的药用基础。针对不同重大疾病的特点及给药方式的差异,对纯化的抗菌肽进行制剂工艺筛选,筛选能有效保护抗菌肽活性的制剂配方工艺,使抗菌肽效价能保持 90%以上。 4、技术的成熟程度,适用范围和安全性:技术已成功进行了成果转化并实现了产业化生产;替代抗阴性菌的抗生素,对革兰氏阴性菌有很强的杀菌力;无毒无残留。 5、应用情况: 本项目形成一个抗菌肽产品,其安全、低毒、低残留, 具有超强的稳定性,具有热稳定性,可耐受饲料制粒时的高温而不失活;抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解,保证其经消化道不被破坏;在较宽的pH 值范围内可保持较强的活性。 目前该产品有粉剂和液体制剂两种剂型,可用于畜禽、水产动物中,能有效解决腹泻,对大肠杆菌、绿脓杆菌、沙门氏菌等细菌和痢疾阿米巴原虫有明显的抑制消灭作用,显著降低乳仔猪黄白痢、红痢、 传染性胃肠炎以及流行性腹泻的发病机率,还可显著增强免疫,刺激动物机体产生天然的免疫反应,提高机体免疫应答能力、抗体水平, 并可连接先天性免疫与获得性免疫,同时可高效结合并清除肠道内的霉菌毒素、细菌毒素。 该产品已经得到广大用户的认可,包括正大集团、新希望集团、通威股份、双胞胎集团、大北农集团、安佑集团等大型饲料企业,并与其建立了长期的合作关系。 6、成果简介: 本项目与华南农业大学以技术合作及专利独占实施许可的方式进行研究,利用现代化生物基因工程技术,设计、合成新型抗菌肽基因工程菌,并将其转化于毕赤酵母中胞外分泌表达,通过发酵生产抗菌肽。该抗菌肽抗菌效果明确,性能稳定,产品主要用于饲养肉鸡、猪及对虾饲料中替代或减少抗生素抗菌促生长剂的使用。在示范养殖基地开展的减少或部分替代抗生素实验数据表明,可有效提高动物抗病能力,促进动物生长,试验证明应用效果显著,且产品具有热稳定性好,能耐受饲料制粒时的高温,可进行规模化生产与应用。因此作为一种我国现有养殖模式下的替代抗生素或减少抗生素使用的一种新型饲料添加剂具有广阔的研究及产业化应用前景。该技术成果经科技厅鉴定为国际先进水平。为提高其生物表达量,降低本项目产品的生产成本,海钠川药业股份有限公司委托美国 Welgen 公司在抗菌肽前期研究成果的基础上,利用美国 Welgen 公司先进的基因工程技术,对抗菌肽进行高效表达菌株的再次构建与高效表达研究,海纳川药业股份有限公司进行一系列产业化生产及动物养殖试验及转基因生物安全评价,进行产业化研究,通过研究建立产业化生产工艺、产品及质量标准,开展应用研究,形成产品应用技术标准,建立年产 200 吨抗菌肽中试生产线,并进行前期市场应用推广,为产品的大规模生产提供技术支撑,为行业应用提供技术标准。